کارآموزی ژن درمانی

ژن درمانی: پیشرفت ها، چالش ها و دیدگاه ها

توانایی ایجاد تغییرات اختصاصی در ژنوم انسان از زمان به رسمیت شناختن ژن به عنوان واحد اساسی وراثت در پزشکی یک هدف بوده است. بنابراین، ژن درمانی به عنوان توانایی بهبود ژنتیکی از طریق اصلاح ژن‌های تغییر یافته (جهش یافته) یا تغییرات مختص مکان با اهداف درمانی را مورد هدف قرار می دهد.

این درمان از طریق پیشرفت‌های ژنتیک و مهندسی زیستی امکان‌پذیر شد که وکتورها را برای تحویل مواد خارج کروموزومی به سلول‌های هدف دستکاری کرد. یکی از محورهای اصلی این تکنیک، بهینه سازی وسایل انتقال (وکتورها) است که عمدتا پلاسمید، نانوساختار یا ویروس هستند. این ویروس ها بیشتر به دلیل برتری آنها در حمله به سلول ها و وارد کردن مواد ژنتیکی آنها مورد بررسی قرار می گیرند.

با این حال، نگرانی زیادی در مورد تشدید پاسخ های ایمنی و دستکاری ژنوم، به ویژه در سلول های زایا وجود دارد. مطالعات in vivo در سلول های سوماتیک نتایج رضایت بخشی را با پروتکل های تایید شده در آزمایشات بالینی نشان داد. این آزمایشات در ایالات متحده، اروپا، استرالیا و چین انجام شده است.

پیشرفت‌های بیوتکنولوژیکی اخیر، مانند سلول‌های بنیادی پرتوان القایی در بیماران مبتلا به بیماری‌های کبدی، ایمونوتراپی سلول T گیرنده آنتی ژن کایمریک و ویرایش ژنومی توسط CRISPR/Cas9 مورد بررسی قرار گرفته‌اند.

در سال 1991، جیمز واتسون اعلام کرد که بسیاری از مردم می گویند که نگران تغییرات در دستورالعمل های ژنتیکی ما هستند. اما این دستورالعمل‌های ژنتیکی صرفا محصول تکامل هستند و به گونه‌ای شکل گرفته‌اند که بتوانیم با شرایط خاصی که ممکن است دیگر وجود نداشته باشند، سازگار شویم.

مطالعات ژنتیکی در اوایل دهه 1850 آغاز شد، زمانی که راهب اتریشی، گرگور مندل، در مجموعه ای از آزمایشات با نخود سبز، الگوی وراثت را با مشاهده آثاری که به عنوان واحدهای جداگانه به ارث رسیده بودند، توصیف کرد که امروزه ما آنها را به عنوان ژن می شناسیم.

تا سال 1950، اطلاعات کمی در مورد ماهیت فیزیکی ژن ها وجود داشت، یعنی زمانی که بیوشیمیدان آمریکایی، جیمز واتسون و بیوفیزیکدان انگلیسی، فرانسیس کریک، مدل انقلابی DNA دو رشته ای را توسعه دادند. در سال 1970، محققان مجموعه‌ای از آنزیم‌ها را کشف کردند که امکان جداسازی ژن‌ها را در مکان‌های از پیش تعیین‌شده در امتداد مولکول DNA و قرار دادن مجدد آن‌ها به شیوه‌ای تکرارپذیر فراهم می‌کرد.

این پیشرفت های ژنتیکی سناریوی ظهور مهندسی ژنتیک را با تولید داروها و آنتی بادی های جدید آماده کرد و از سال 1980، ژن درمانی توسط دانشمندان گنجانده شد. در این بررسی، ژن درمانی، روش‌های مختلف مهندسی ژنتیک مورد استفاده برای این تکنیک، محدودیت‌ها، کاربردها و دیدگاه‌های آن را پوشش می‌دهیم.

ژن درمانی

همانطور که گفته شد، توانایی ایجاد تغییرات موضعی در ژنوم انسان از زمان شناخت DNA به عنوان واحد اساسی وراثت، هدف پزشکی بوده است. ژن درمانی به عنوان ظرفیت بهبود ژن با استفاده از اصلاح ژن های تغییر یافته (جهش یافته) یا تغییرات مختص مکان درک می شود. در ادامه، استراتژی‌های مختلفی شرح داده شده است که اغلب برای این منظور استفاده می‌شوند.

در حال حاضر، ژن درمانی منطقه ای است که عمدتا در آزمایشگاه های تحقیقاتی وجود دارد و کاربرد آن هنوز تجربی است. این رویکرد گسترده است که قادر به درمان بالقوه بیماری های ناشی از اختلالات ژنی مغلوب (فیبروز کیستیک، هموفیلی، دیستروفی عضلانی، و کم خونی داسی شکل)، بیماری های ژنتیکی اکتسابی مانند سرطان، و برخی عفونت های ویروسی مانند ایدز می باشد.

یکی از تکنیک‌هایی که اغلب مورد استفاده قرار می‌گیرد شامل فناوری DNA نوترکیب است که در آن ژن مورد نظر یا ژن سالم در یک ناقل قرار داده می‌شود که می‌تواند یک پلاسمید، نانوساختار یا ویروس باشد. این دومی به دلیل کارایی آن در حمله به سلول ها و معرفی مواد ژنتیکی، بیشترین کاربرد را دارد.

اگرچه چندین پروتکل موفقیت آمیز برای ژن درمانی وجود دارد ولی روند ژن درمانی همچنان پیچیده است و بسیاری از تکنیک ها به پیشرفت های جدید نیاز دارند. سلول های خاص بدن که نیاز به درمان دارند باید شناسایی و در دسترس باشند.

راهی برای توزیع مؤثر نسخه‌های ژنی در سلول‌ها باید در دسترس باشد و بیماری‌ها و پیوندهای ژنتیکی دقیق آنها باید کاملا درک شود.

همچنین موضوع مهم دیگر، نوع سلول‌های هدف در ژن‌درمانی است که به دو گروه بزرگ تقسیم می شوند:  ژن درمانی germline و ژن درمانی سلول های سوماتیک. در ژن درمانی germline، سلول های بنیادی با اسپرم و تخمک، با معرفی ژن های عملکردی اصلاح می شوند و در ژنوم ادغام می شوند. تغییرات ارثی هستند و به نسل های بعدی منتقل می شوند.

در تئوری، این رویکرد باید در مبارزه با بیماری های ژنتیکی و ارثی بسیار موثر باشد. ژن درمانی سلول سوماتیک زمانی است که ژن های درمانی به سلول های بدنی بیمار منتقل می شود. هر گونه تغییر و هر گونه تاثیری فقط به آن بیمار محدود می شود و به نسل های آینده به ارث نمی رسد.

فرآیند ژن درمانی: آزادسازی ژن

در ژن درمانی، یک ژن طبیعی به ژنوم وارد می شود تا جایگزین یک ژن غیر طبیعی مسئول ایجاد یک بیماری خاص شود. از میان چالش‌های مختلف درگیر در این فرآیند، یکی از مهم‌ترین چالش‌ها، مشکل در آزادسازی ژن در سلول بنیادی است.

بنابراین، یک حامل مولکولی به نام وکتور برای آزاد کردن ژن استفاده می شود، که باید بسیار خاص باشد، کارایی را در آزادسازی یک یا چند ژن در اندازه های لازم برای کاربردهای بالینی نشان دهد، که توسط سیستم ایمنی تشخیص داده نشود و در مقادیر زیاد و غلظت بالا خالص شود تا بتوان آن را در مقیاس وسیع تولید و در دسترس قرار داد.

هنگامی که وکتور وارد بیمار می شود، نمی تواند واکنش های آلرژیک یا فرآیند التهابی را القا کند. باید عملکردهای طبیعی را افزایش دهد، کمبودها را اصلاح کند یا از فعالیت های مضر جلوگیری کند. علاوه بر این، نه تنها برای بیمار، بلکه برای محیط زیست و متخصصانی که آن را دستکاری می کنند نیز باید ایمن باشد. در نهایت، وکتور باید قادر به بیان ژن، به طور کلی، برای کل زندگی بیمار باشد.

اگرچه کارایی ناقل های ویروسی تایید شده است، اخیرا برخی از مطالعات نشان داده اند که استفاده از این حامل ها با محدودیت های متعددی همراه است. وجود ماده ژنتیکی ویروسی در پلاسمید یک عامل تشدید کننده قوی است، زیرا می تواند یک پاسخ ایمنی حاد را القا کند. در حال حاضر، دو رویکرد اصلی برای تغییرات ژنتیکی سلول‌ها وجود دارد که یکی با واسطه ویروس و یکی از طریق مکانیسم‌های فیزیکی می باشد.

در این زمینه، پلیمرهایی وجود دارند که شبکه‌هایی را تشکیل می‌دهند که یک ژن را جذب کرده و هنگامی که آنها به سلول ها نفوذ می کنند، بار آن را آزاد می کنند، مانند DNA microinjection، پلیمرهای کاتیونی، لیپوزوم های کاتیونی و … .

هر تکنیک معرفی مواد اگزوژن با دیگری متفاوت است و به نوع کاربرد پیشنهادی بستگی دارد. برخی کارآمدتر هستند، برخی دیگر برای حمل ژن های بزرگ (> 10 کیلوبایت) و ادغام با ژنوم، امکان بیان دائمی را دارند.

ژن درمانی و سلول های بنیادی خون ساز

سلول های بنیادی خونساز به دلیل پتانسیل بالا برای طول عمر و ظرفیت خود بازسازی به اهداف ایده آلی برای انتقال ژن تبدیل شده اند. یکی از نمونه‌های این ترکیب ژن درمانی و سلول‌های بنیادی، تولید ناقل‌های انتقال ژن برای ایجاد سلول‌های بنیادی پرتوان القایی (iPS)، به منظور ایجاد تمایز iPS و ارائه یک فنوتیپ اضافی از این سلول مشتق شده تمایز یافته است.

بیماران مبتلا به بیماری مزمن کبدی و عفونت با ویروس هپاتیت (به عنوان مثال ویروس هپاتیت B و ویروس هپاتیت C) که نیاز به پیوند کبد دارند، ممکن است تحت تاثیر پیوند کبدی سلول‌های کبدی بالغ یا آنهایی که از iPS مشتق شده‌اند، قرار گیرد. تنها انتقال ژن ها ممکن است برای تبدیل سلول های بنیادی به سلول های کبدی مورد نیاز باشد.

از آنجایی که سلول‌های پیوندی مستعد عفونت مجدد توسط ویروس هپاتیت هستند، انتقال ناقلی که یک RNA سنجاق سری کوتاه را که علیه ویروس است کد می‌کند، سلول‌های انتقال‌یافته را با مقاومت یا ایمنی در برابر عفونت مجدد ایجاد می‌کند. سلول های مقاوم می توانند به مرور زمان کبد را مجددا جمع کنند و عملکرد طبیعی کبد را بازیابی کنند.

درمان با سلول های T گیرنده آنتی ژن کایمریک

درمان از طریق سلول T گیرنده آنتی ژن کایمریک (CAR-T)، نوعی ایمونوتراپی است که شامل دستکاری یا برنامه ریزی مجدد سلول های ایمنی (لنفوسیت های T) خود بیماران به منظور شناسایی و حمله به سلول های T تومور است.

پیشرفت اولیه در طراحی اولین نسل CAR توسط اشهر و همکاران با ادغام یک متغیر تک زنجیره ای (scFv) به یک حوزه گذرنده و یک واحد سیگنال دهی درون سلولی مشخص شد: زنجیره CD3 zeta. این طرح، عنصر فعال یک آنتی بادی مونوکلونال به خوبی مشخص شده را با یک دامنه سیگنالینگ ترکیب می کند و تشخیص اپی توپ خاص تومور و فعال شدن سلول های T را بدون وابستگی به مولکول های مجموعه سازگاری بافتی افزایش می دهد.

بهبود در نسل اول CAR با استفاده از ادغام مولکول‌های هم‌تحریک لازم برای انتقال سیگنال انجام شد. گیرنده تحریکی که بیشتر در این نسل CAR استفاده می شود CD28 است. این گیرنده به عنوان دومین رویداد فعال کننده مسیر عمل می کند و تکثیر مشخص سلول های T همراه با افزایش بیان سیتوکین ها را ممکن می سازد.

جدیدترین نسل CAR از افزودن یک دامنه تحریکی برای افزایش عملکرد CAR استفاده کرد. مولکول‌های تحریک‌کننده مشترک به عنوان دریافت‌کننده فاکتور نکروز تومور (CD134 یا CD137) برای این روش مورد نیاز هستند. به طور خلاصه، جدیدترین اشکال CAR شامل scFv، زنجیره اولیه CD3-ζ، همراه با زنجیره های تحریکی CD28 و CD134 یا CD137 است.

با نسل سوم CAR، ژونگ و همکاران بهبودی در فعال سازی سلول T پروتئین کیناز B به نام Akt را نشان دادند که چرخه سلولی را تنظیم می کند. طبق مطالعات دیگر، این نسل آخر ماندگاری سلول های T را در مقایسه با نسل دوم CAR نشان می دهد.

بحرانی ترین نقطه از عوارض جانبی درمان CAR-T، شناسایی سلول های غیر توموری است که اپی توپ هدف را توسط CAR بیان می کنند. آنتی ژن های تومور مولکول هایی هستند که در سلول های تومور به شدت بیان می شوند، اما منحصر به این سلول ها نیستند. به عنوان مثال، آنتی ژن CD19 را می توان در سلول های B طبیعی یا بدخیم یافت و طراحی CAR برای هدف CD19 قادر به تشخیص آنها نیست.

پیشرفت‌های جدید در طراحی وکتورها و آزمایش‌ها با CAR-T تعادل و تقویت ایمنی را برای تقویت کاربرد بالینی فراهم می‌کند. همانطور که از نسل اول تا سوم مشاهده شد، پیشرفت تدریجی در آزمایشات CAR قبلا پیشرفت کرده است. دانش و تجربه به دست آمده در ارزیابی سمیت CAR-T موفقیت پیشرفت های پیشرونده را برای آزمایشات آینده افزایش می دهد.

CRISPR-Cas9

در طول دهه 1980، در ژنوم اشریشیا کلی، منطقه ای با یک الگوی غیرمعمول شناسایی شد که در آن یک توالی بسیار متغیر توسط یک توالی مکرر و بدون عملکرد شناخته شده در هم آمیخت. در سال 2005، فرض بر این بود که توالی‌های متغیر منشأ خارج کروموزومی دارند و به عنوان یک حافظه ایمنی در برابر فاژها و پلاسمیدها عمل می‌کنن که این پدیده آغازگر سیستم CRISPR-Cas9 می باشد که از سال 2012 به عنوان یکی از ابزارهای اولیه بیوتکنولوژی برای ویرایش ژن بکار گرفته شد.

این مکانیسم که در سیستم ایمنی تطبیق پذیر پروکاریوتی ها سرچشمه می گیرد، ماده ژنتیکی مهاجم را شناسایی می کند، آن را به قطعات کوچک می شکافد و آن را در DNA  خود ادغام می کند. در عفونت دوم توسط همان عامل، توالی زیر رخ می دهد: رونویسی مکان CRISPR، پردازش mRNA و ایجاد قطعات کوچک RNA به نام crRNAs که با پروتئین های Cas کمپلکس تشکیل می دهند و اینها اسیدهای نوکلئیک بیگانه را تشخیص می دهند و در نهایت نابودشان می کنند.

بر اساس این مکانیسم طبیعی، تکنیک CRIPSR توسعه یافت که امکان ویرایش توالی‌های DNA خاص هدف ژنوم هر موجود زنده را با استفاده از سه مولکول نوکلئاز (Cas9) که مسئول برش DNA دو رشته ای می باشد. یک RNA راهنما که مجموعه را به سمت هدف هدایت می کند و DNA هدف اینکار انجام می شود.

به دلیل سادگی و دقت آن در مقایسه با سایر تکنیک ها (نوکلئازهای انگشت روی، TALEN و هدف گیری ژن)، سیستم CRISPR به عنوان یک ابزار همه کاره است که ویرایش ژنتیکی را با استفاده از غیر فعال کردن، یکپارچه سازی توالی های اگزوژن و جایگزینی آللی انجام می دهد.

RNA راهنما با DNA هدف هیبرید می شود. Cas9 این کمپلکس را تشخیص می دهد و باید در جداسازی دو رشته DNA و ترمیم در حضور یک DNA دهنده (همولوگ) واسطه شود. نتیجه این فرآیند ادغام یک توالی اگزوژن در ژنوم (knock-in) یا جایگزینی آلل است.

محققان دانشگاه کالیفرنیا و یوتا اخیرا در تصحیح جهش ژن هموگلوبین که منشا کم خونی سلول داسی است، موفق شدند. سلول های CD34+ از بیمارانی که ناقل کم خونی داسی شکل هستند، توسط CRISPR-Cas9 ویرایش شد و پس از 16 هفته، نتایج نشان دهنده کاهش سطح بیان ژن جهش یافته و افزایش بیان ژن از نوع وحشی بود.

فناوری اشاره شده عمدتا در آسیب شناسی های ژنتیکی تک ژنی مورد استفاده قرار می گیرد، که با وجود نادر بودن، می تواند به حدود 10 هزار بیماری که قبلا شرح داده شده است برسد.

مسائل اخلاقی

امکان تغییر ژنتیکی germline برای مدت طولانی موضوع بحث داغ در زمینه علم بوده است. اخلاق زیستی همیشه هنگام ایجاد تکنیک های جدید وجود دارد تا خطرات این روش و پیامدهای اخلاقی مربوطه را ارزیابی کند. بخش بزرگی از جامعه علمی، ژنتیک درمانی را در سلول‌های سوماتیک به ویژه در موارد اختلالات شدید مانند فیبروز کیستیک و دیستروفی عضلانی دوشن تأیید می‌کنند.

اما در سال 2015، محققان چینی از مسائل اخلاقی فراتر رفتند و برای اولین بار اصلاح ژنتیکی سلول های جنینی را با استفاده از تکنیک CRISPR-Cas9 اعلام کردند. سپس، یک گروه چینی دیگر نیز انجام همان فرآیند را با هدف ایجاد مقاومت در برابر HIV با درج جهش ژن CCR5 گزارش کردند. تجزیه و تحلیل ژنتیکی نشان داد که 4 جنین از 26 جنین با موفقیت اصلاح شدند. نتیجه به وضوح نیاز به بهبود تکنیک را نشان می دهد و هشدار می دهد که احتمالا چنین آزمایشاتی می تواند قبلا در مدل های حیوانی آزمایش شود.

این انتشارات اخیر دوباره بحث در مورد ویرایش ژنتیکی را برانگیخت. از یک طرف، کمیته اخلاق ژاپن اعلام کرد که روش انجام آزمایش صحیح است، زیرا تأییدیه کمیته اخلاق محلی برای مطالعه انجام شده و همچنین رضایت اهداکنندگان تخمک وجود دارد. در انگلستان، اولین پروژه برای ویرایش جنین انسان سالم مورد تایید قرار گرفت. از سوی دیگر، گروه‌های تحقیقاتی آمریکایی محافظه‌کار باقی ماندند و موضع خود را مبنی بر عدم حمایت از این نوع آزمایش‌ها تکرار کردند و اعلام کردند که منتظر بهبود تکنیک‌ها و تعاریف مسائل اخلاقی هستند.

از زمان اعلام جیمز واتسون در سال 1991، با اشاره به بهینه سازی احتمالی ژنتیک انسانی، ژن درمانی در طول دهه ها پیشرفت کرده است، چه با بهینه سازی انواع ناقل ها، چه با معرفی تکنیک های جدید، مانند سلول های بنیادی پرتوان القایی در ترکیب با مدل‌های فعلی ویرایش ژنتیکی مانند CRISPR-Cas9 و حتی با آزمایش هایی در سلول های germline و جنبه های اخلاقی شاهد پیشرفت در این زمینه بوده ایم.

موفقیت‌ها در زمینه ژن درمانی در حال حاضر قابلیت دوام درمان‌های با استفاده از ژن درمانی را در عمل بالینی، به عنوان یک شکل جایگزین برای بیماران مبتلا به بیماری‌های مادرزادی یا اختلالات تک‌ ژنی و سرطان، به‌ویژه زمانی که مداخلات دارویی یا جراحی نتایج خوبی نشان نمی‌دهند، تقویت کرده است.

طراحی وکتورهای آزمایشی جدید، افزایش کارایی، ویژگی سیستم های تحویل و درک بیشتر از القای پاسخ التهابی ممکن است بهبود ایمنی را با گسترش تکنیک ها در کاربردهای بالینی متعادل کند. با این حال، دانش و تجربه به‌دست‌آمده با ارزیابی دقیق سمیت این فناوری‌ها، پیشرفت‌های قابل توجهی را در کاربرد این روش‌ها ممکن می‌سازد.

بنابراین، از نظر تاریخی، ژن درمانی و کشف آنتی بیوتیک ها و عوامل شیمی درمانی یا هر فناوری جدید نیاز به مطالعات پیش بالینی روشن تر دارد. در آینده، نوید استفاده از این تکنیک ها در چندین زمینه پزشکی و درصد بیشتری از کارآزمایی های بالینی وجود دارد.

1. Mukherjee S. Mukherjee S. The gene: an intimate history. Nova York: Scribner; 2016. Genetic therapies: posthuman gene therapy.415 Chap. 34. [Google Scholar]
2. Friedmann T. A brief history of gene therapy. Nat Genet. 1992;2(2):93–98. Review. [PubMed] [Google Scholar]
3. Misra S. Human gene therapy: a brief overview of the genetic revolution. J Assoc Physicians India. 2013;61(2):127–133. Review. [PubMed] [Google Scholar]
4. Tebas P, Stein D, Tang WW, Frank I, Wang SQ, Lee G, et al. Gene editing of CCR5 in autologous CD4 T cells of persons infected with HIV. N Engl J Med. 2014;370(10):901–910. [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
5. Linden R. Gene therapy: what it is, what it is not and what it will be. Estud Av. 2010;24(70):31–69. [Google Scholar]
6. Ginter EK. Gene therapy of hereditary diseases. Vopr Med Khim. 2000;46(3):265–278. Review. Russian. [PubMed] [Google Scholar]
7. Mathews QL, Curiel DT. Gene therapy: human germline genetics modifications-assessing the scientific, socioethical, and religious issues. South Med J. 2007;100(1):98–100. [PubMed] [Google Scholar]
8. Bank A. Human somatic cell gene therapy. Bioessays. 1996;18(12):999–1007. Review. [PubMed] [Google Scholar]
9. Nabel GJ, Chang AE, Nabel EG, Plautz GE, Ensminger W, Fox BA, et al. Immunotherapy for cancer by direct gene transfer into tumors. Hum Gene Ther. 1994;5(1):57–77. [PubMed] [Google Scholar]
10. Yang Y, Nunes FA, Berencsi K, Furth EE, Gönczöl E, Wilson JM. Cellular immunity to viral antigens limits E1-deleted adenoviruses for gene therapy. Proc Natl Acad Sci U S A. 1994;91(10):4407–4411. [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
11. Kay MA. State-of-the-art gene-based therapies: the road ahead. Nat Rev Genet. 2011;12(5):316–328. Review. [PubMed] [Google Scholar]
12. Eshhar Z, Waks T, Gross G, Schindler DG. Specific activation and targeting of cytotoxic lymphocytes through chimeric single chains consisting of antibody-binding domains and the gamma or zeta subunits of the immunoglobulin and T-cell receptors. Proc Natl Acad Sci U S A. 1993;90(2):720–724. [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
13. Gross G, Waks T, Eshhar Z. Expression of immunoglobulin-T-cell receptor chimeric molecules as functional receptors with antibody-type specificity. Proc Natl Acad Sci U S A. 1989;86(24):10024–10028. [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
14. Parham P. Parham P. The immune system. 3rd. Nova York: Garland Science; 2009. Antigen recognition by T lymphocytes.113 Chap. 5. [Google Scholar]